Micotoxine, generalităţi aflatoxinele

Micotoxinele prezente în mod natural în diversele produse alimentare constituie o problemă de siguranţă alimentară. Studiile epidemiologice efectuate în India şi în unele ţări din Africa au arătat o asociere între consumul de alimente contaminate cu aflatoxine şi creşterea incidenţei cancerului hepatic.

Organul ţintă care suferă leziuni grave în cazul intoxicaţiilor cu aflatoxine este ficatul. Aflatoxicoza acută se poate manifesta prin hemoragii, insuficienţă hepatică acută şi chiar moartea. Doza mortală diferă de la animal la animal şi depinde de mulţi factori cum ar fi cantitatea de aflatoxină ingerată, vârsta animalului, starea de sănătate şi starea de nutriţie.

Consumul unei cantităţi mai mici, dar timp mai îndelungat duce la apariţia intoxicaţiei cronice. Efectele şi simptomele sunt în general greu de pus în evidenţă atât din cauza intensităţii reduse dar mai ales din cauza caracterului lor nespecific. Aflatoxicoza cronică trebuie suspectată când în lipsa altor cauze evidente, animalele au tulburări digestive persistente însoţite de reducerea sporului în greutate. Micotoxinele sunt substanţe naturale, ce apar ca produşi secundari în urma dezvoltării ciupercilor parazite (Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Claviceps şi Alternaria) la plante şi la produsele depozitate şi utilizate apoi în hrana oamenilor şi animalelor. Ele sunt substanţe toxice ce prezintă riscuri semnificative pentru siguranţa alimentaţiei cotidiene, printre acestea amintim aflatoxinele, fumonisinele, ocratoxinele, patulina, trichotecina şi ergotoxina (2,7).

Contaminarea unui produs alimentar sau furajer cu micotoxine nu presupune prezenţa obligatorie a fungului elaborator sau modificarea caracteristicilor organoleptice ale produsului (aspect, culoare, miros, gust), ceea ce face imposibilă decelarea micotoxinei, dacă alimentele şi furajele nu sunt supuse unui control micotoxicologic riguros periodic (7).

Toxicitatea micotoxinelor se exprimă prin DL50, iar acest mod de exprimare prezintă unele carenţe: nu ia în considerare decât efectele letale, oferă date experimentale pe animale, în special animale de laborator, ce nu pot fi extrapolate la om şi exclude “toxicitatea cumulativă, determinată de expunerea repetată la doze mici (9).

Există în momentul de faţă circa 300-400 micotoxine, care aparţin celor 24 de grupe chimice de toxine ce pot apărea în condiţii din cele mai diferite în producţiile agricole şi în diferitele alimente obţinute din acestea.

Acţiunea biochimică a acestor toxine constă în inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor din celule, în consecinţă, se inhibă diviziunea celulară (23,25).

Un studiu american arată că micotoxinele sunt de 10.000 ori mai periculoase decât reziduurile de pesticide (25).

Deosebita stabilitate chimică a majorităţii micotoxinelor, face aproape imposibilă detoxifierea produselor contaminate cu micotoxine prin metode fizice (sterilizarea prin temperaturi ridicate, refrigerarea, deshidratarea, desicarea, liofilizarea, iradierea) sau chimice (extragerea cu solvenţi, modificarea structurii moleculare prin oxidare, hidroxilare etc.) (1,2).

Sensibilitatea animalelor la micotoxine

Intoxicaţia cu micotoxine a animalelor şi oamenilor este denumită micotoxicoze. Trebuie reţinute, următoarele aspecte:

  • ele apar cu o frecvenţă destul de mare şi la fel de frecvent nu sunt recunoscute;
  • modificarea stării de sănătate nu apare la toată populaţia de animale, aceasta înseamnă că micotoxinele nu sunt infecţioase;
  • tratamentul cu antibiotice sau alte medicamente nu aduce nici un rezultat;
  • declanşarea bolii poate apărea sezonal fiind influenţată de condiţiile de climă care favorizează formarea micotoxinelor, în asemenea situaţii, creşte mult frecvenţa micotoxinelor;
  •  nu se defineşte, întotdeauna, o relaţie clară cu sursa de furaj contaminat (2,3,4).

Efecte nocive ale micotoxinelor asupra organismului uman şi animal

Majoritatea micotoxinelor au capacitate cancerigenă. Mecanismul cancerigen al acestora se manifestă prin capacitatea lor  de a se fixa pe ADN, cu producerea de alterări sub formă de mutaţii. Din gama mare de micotoxine atenţia este îndreptată spre aflatoxine, ochratoxine, sterigmatocistine, patulina (6,7,23).

Aflatoxinele, structură, efecte patogene

După accidentul observat în 1960 în crescătoriile de curci  (100.000 păsări moarte), numeroase cercetări au fost conduse spre un grup de molecule cu înalte proprietaţi toxice: aflatoxinele. Aflatoxinele (AF) constituie un  grup de 18 compuşi cu structuri apropiate unde 4 compuşi au forme foarte frecvent întâlnite în alimente: B1, B2, G1 si G2. (32)

Din punct de vedere chimic, aflatoxinele sunt un ansamblu dintre o cumarină şi trei furani. Sunt molecule cu masă moleculară mică (312 - 330 g/mol. Sunt solubile în apă, insolubile în solvenţi nepolari. Foarte solubile în solvenţi organici (cloroform şi alcool metilic), fiind uşor de extras. La lumina ultravioletă, sunt fluorescente (albastru pentru AFB, verde pentru AFG, AFM1 prezintă o fluorescenţă albastru-mov) (19).

În prezent s-au pus la punct metode şi tehnici de izolare, identificare, dozare, chiar sinteză a micotoxinelor, astfel încât sunt descrise câteva sute de micotoxine, unele dintre ele fiind considerate micotoxine majore.

Mecanismul de acţiune al aflatoxinelor la nivel celular

 Aflatoxina B1 pătrunde în celulă şi este fie metabolizată de monooxigenază în reticulul endoplasmatic obţinîndu-se produşi metabolici hidroxilaţi care sunt ulterior metabolizaţi la glucuronid şi conjugaţi sulfuraţi;  fie este oxidată obţinându-se epoxidul reactiv care este hidrolizat spontan şi se poate lega de proteine devenind citotoxic. Epoxidul poate reacţiona cu ADN-ul sau cu proteinele, sau poate fi transformat  de o glutationă, S-transferaza la (GSH) – conjugat (7).

Datorită efectelor negative asupra organismului animal şi uman, limitele maxime admise de aflatoxine în produsele alimentare sunt cuprinse între 0.05-15 (μg/kg).

Modificarile identificate ca rezultat al infestaţiei la animale şi păsări sunt reducerea greutăţii şi a depozitelor de grăsime, hemoragie internă, icter, necroza ficatului şi ciroză. La pui, AFB1 are un procent letal de 50% într-o doză de 9,28mg/kg. Aflatoxicoza este carcinogenică şi teratogenă pentru fetuşii mamiferelor. Efectele aflatoxinelor pot fi potenţate de contaminarea cu alte micotoxine, ex.: diacetoxyscirpenol, acidul cyclopiazon, ochratoxine, deoxynivalenol şi toxina T-2. În contrast cu celelalte descoperiri, a fost raportată şi o sinergie seminificativă între aflatoxine şi acidul ciclopiazonic (24) .

Aspergillus flavus   

Este micetul din cultura căruia s-a izolat pentru prima dată aflatoxina B1, o micotoxină cu structură difurano - cumarinică, considerată carcinogen uman de gradul I. Aspergillus flavus se găseşte în mod obişnuit la cereale, citrice şi arahide şi este una din speciile de mucegai cunoscute ce produc aflatoxină care pot cauza hepatite acute, imunosupresie şi carcinomul hepatocelular. Mucegaiul invadează bobul şi se dezvoltă cu precădere în jurul embrionului, astfel încât procesele tehnologice care implică separarea germenilor de endosperm pot reduce concentraţia aflatoxinelor în cele din urmă. Evident, o mare parte din aflatoxină rămâne în embrioni şi aceştia reprezintă o sursă toxică importantă pentru om si animale.  

Absenţa oricărei reglementări în ceea ce priveşte întocmirea unor liste cu ciuperci, în ţările care prezintă un risc mare de apariţie a hepatitelor virale creşte de asemenea, riscul apariţiei carcinomului hepatocelular (31)

Aspergillus flavus este al doilea ca importanţă dintre miceţii izolaţi din familia Aspergillaceae, primul fiind Aspergillus fumigatus. Aspergillus invadează arterele din zona creierului şi cauzează infarctul cerebral (7).

Aspergillus flavus se dezvoltă pe cultură având culoare galbenă. Speciile de Aspergillus se pot distinge prin apariţia conidiilor sau a „capului fructificator”.

La om, în cazuri rare, Aspergillus flavus îşi poate continua ciclul de viaţă în interiorul corpului, cu localizare cefalică, producând aspergiloza intracraniană, boală gravă, de cele mai multe ori letală.

În general, aspergiloza apare la pacienţii imunocompromişi sau la agricultori, la care sporii de Aspergillus flavus se localizează în sinusul paranazal (7).

Aspergillus flavus produce în principal aflatoxinele B1 si B2, neavând rol în producerea celor de tip G1 ăi G2, în timp ce Aspergillus parasiticus le produce pe toate 4.

AFB1 este cea mai toxică, dupa care urmează AFM1 (M1 = Milk 1 găsită în laptele de la o vacă infestată prin alimentaţia cu furaje contaminate), AFB2 şi AFG2 (7). Toxicocinetica AFB1

Absorbţia se poate face pe cale orală sau traheală datorită lipofilelor care reglementează deplasarea printr-un mecanism de difuzie pasivă. Deplasarea se face rapid, la nivelul intestinului subţire prin porţiunea duodenală, AFB1 trecând în ficat prin vena portă (6,7).

Distribuţia. Stocarea sa în organism se face datorită legăturilor covalente cu moleculele tisulare, ca exemplu putându-se constata şi pasajul transplacentar al aflatoxinelor.

Metabolizarea AFB1

Aflatoxinele B1 pentru a fi toxice sau mutagene, trebuiesc metabolizate fixându-se pe macromolecule. Acest lucru este realizat de citocromul P (CYP) hepatic şi sunt transformate în metaboliţii următori: : AFB2a, AFQ1, AFP1, aflatoxicol H1, AFM1, aflatoxicol M1 şi epoxyde-AFB1 (cu exceptia epoxyde-AFB1   şi  AFM1 sunt mai puţin toxici) (6,7)

Eliminarea

  •  pe cale biliară: reprezintă 60% din eliminarea totală, privind toţi metaboliţii formaţi, câteodată AFB1 în forma liberă;
  • pe cale urinară: se regăsesc metaboliţi ce servesc ca marker în intoxicaţii;
  • prin lactaţie: doar AFM1

Aspergillus Parasiticus este unul din mucegaiurile ce produce aflatoxină şi care se găseşte uneori în măslinele negre.

Aspergillus parasiticus produce ambele aflatoxine B şi G şi are o distribuţie mai limitată faţă de Aspergillus flavus, care se găseşte pretutindeni (7).

Aflatoxinele au pe de altă parte un rol asupra fosforilărilor şi lipogenezei.

Patologia aflatoxicozelor

Acţiunea cancerigenă a aflatoxinelor se manifestă în principal prin apariţia carcinoamelor hepatocelulare

Pot fi observate  4 tipuri de alterări hepatocitare: hiperplazia, creşterea bazofiliei  a euzinofiliei şi a numărului de vacuole lipidice. Acestora li se asociază noduli de euzinofilie, se produce alterarea capacităţii de fixare a lectinelor ca şi în celulele maligne, apoi sugerând că euzinofilia stă la originea apariţiei ulterioare a hepatocarcinoamelor (24).

Principala ţintă a aflatoxinelor, regăsită la speciile studiate este fără îndoială, ficatul. Modificarile identificate ca rezultat al infestaţiei la animale şi păsări sunt reducerea greutăţii şi a depozitelor de grăsime, hemoragie internă, icter, necroza ficatului şi ciroză. La pui, AFB1 are un procent letal de 50% într-o doză de 9,28mg/kg. Aflatoxicoza este carcinogenică şi teratogenă pentru fetuşii mamiferelor. Efectele aflatoxinelor pot fi potenţate de contaminarea cu alte micotoxine, ex.: acidul cyclopiazon, ochratoxine, deoxynivalenol şi toxina T-2. În contrast cu celelalte descoperiri, a fost raportată şi o sinergie seminificativă între aflatoxine şi acidul ciclopiazonic (24) .

Răspunsul sistemului hematopoietic în infecţia cu aflatoxine, a fost studiat de Tung şi colab, aceştia raportând o reducere semnificativă a hemoglobinei şi a eritrocitelor. Există deasemenea date contradictorii care arată că parametrii hematologici nu sunt afectaţi de infecţiile  produse prin aportul de aflatoxine 500 ppb.

Aflatoxicoza la o doză de 200µg/g hrană, poate scădea semnificativ spermatogeneza la masculii de reproducţi. Clarke şi colab.(1987) au condus un studiu pentru investigarea modificărilor endocrine şi testiculare la masculii de pui, asociate cu ingestia de 10 sau 20 ppm AF în 3 stadii diferite de dezvoltare, descoperind că nivelul de plasmă al hormonului luteinizant (LH) la vârsta de 6 săptămâni a fost semnificativ mai mic, în timp ce la masculii mult mai în vârstă nu au fost constatate modificări. Conform acestui raport, întârzierile la vârfurile de LH, la fel ca şi supresia testosteronului şi greutatea testiculelor, indică o posibilă întârziere în maturizarea sexuală asociată cu aflatoxicoza la pui (27).

Răspunsul imun la infecţia AF este scăzut şi pare să difere de la o linie de pui la alta. Imunitatea mediată celular este deasemenea afectată de administrarea aflatoxinelor. Regresia bursei lui Fabricius a fost deasemenea raportată în aflatoxicoză (32).

Aflatoxinele au aratat selectivitate pentru sensibilitate la pui şi alte animale, în infestaţia ce interferează cu dezvoltarea răspunsului imun.

Smith şi colab. au sugerat că AFB1  nu este selectivă specific în ataşarea de ţesutul animal. Ei au observat leziuni uşoare în miocard, creier şi tesutul osos în paralel cu leziunile la ficat şi muşchiul trapez. Efectul aflatoxinelor asupra funcţiilor renale (echilibrul acido-bazic, debitul urinar, rata de filtrare a glomerulului) au fost descrise de Glahn şi colab. (1990). Ei au raportat că aflatoxicoza a scăzut eliminarea fracţionala a fosforului (EFF) şi a concentraţiei de plasmă Ca++, dar nu a alterat semnificativ  alte funcţii renale (33).

Semne clinice

Semnele clinice asociate cu boli de ficat sunt foarte variabile de multe ori manifestându-se  vag atribuindu-se asfel altor boli. Pentru că ficatul este un organ mare şi are o capacitate mare de regenerare atacurile asupra ficatului pot să nu provoace boli semnificative astfel multe păsări rămânand asimptomatice (32).

Semnele clinice includ manifestări parţiale sau totale de anorexie, letargie, depresie, diaree, poliurie, polidipsie, dispnee, calitatea scăzută a penelor şi slăbiciune (32,33).

Mai multe semne specifice de boală hepatică includ distensie abdominală, creştere exagerată şi vânătăi în cioc, melenă, peteşii, hemoragie acută şi deces (33).

Patologie clinică

Ficatul îndeplineşte mai multe funcţii, astfel bolile care afectează acest organ pot avea ca rezultat atât modificari biochimice cât şi morfologice. Prin urmare, analizele  hematologice, biochimice, electroforeza proteinelor, acizilor biliari şi evaluarea citologică a fluidelor sau ţesuturilor sunt toate instrumente utile pentru evaluarea bolii hepatice la păsari (23).

Prin hemoleucograma (CBC)  s-au observat modificări sugestive ale bolii hepatice incluzând leucocitoză sau leucopenie (în funcţie de etiologie), anemie  non-regenerativă sau hemoragică, hipo sau hiperproteinemie (în funcţie de cronicitatea bolii.

Colosterolul

Concentraţii crescute ale colesterolului sunt asociate cu o varietate de afectiuni şi boli, inclusiv afecţiuni endocrine (hipotiroidie, hiperadrenocorticism şi diabet zaharat), sindrom nefrotic, nefropatie, boala obstructivă hepato-biliara, pancreatită acută şi disfuncţie hepatică. Intervalele de referinţă pentru colesterol nu au fost încă bine determinate la păsări; cu toate acestea, valorile normale sunt foarte variabile (23).

Creşterea colesterolului poate fi asociată cu lipemia sau alte forme ale bolilor de ficat, hipotiroidism, obstrucţia ductului biliar, dieta cu un continut ridicat in grăsimi, xanthomatoza sau ateroscleroza. Scăderea concentraţiei plasmatice de colesterol a fost asociată cu unele cazuri de insuficienţă hepatică.

Glucoza

Hipoglicemia poate rezulta din insuficienţa/disfuncţia hepatică, septicemie, neoplazie, infecţi/inflamatii, tulburări de malabsorpţie  şi boli urinare (23).

Acidul uric

Concentraţia de acid uric este un produs deosebit de important pentru păsări. Acesta este produs în ficat şi eliminat prin secreţie tubulară independentă. Hipouricemia este rareori văzută la păsări în comparaţie cu hiperuricemie, deoarece acidul uric este sintetizat în ficat. Hipouricemia poate sugera boală hepatică severă (32).

Enzimele hepatice

Depistarea bolilor hepatocelulare la păsările prin intermediul enzimologiei poate fi dificilă din cauza lipsei unui indicator sensibil la afecţiunea hepatică.

Interpretarea modificărilor în activitatea echipamentului enzimatic ar trebui să fie efectuata judicios şi cu înţelegerea faptului că o corelare a nivelurilor enzimei cu bolile hepatocelulare poate fi dificilă şi poate să rezulte dintr-o scădere a funcţiilor acestuia, nicidecum în urma unei infecţii.

Fosfataza alcalină / Alcalin Fosfataza (ALP) care poate apărea din ficat, cu toate că activitatea acestei enzime în ficat este considerată scăzuta. Creşterea activităţii ALP la păsări este frecvent asociată cu activitatea osteoblaştilor, a creşterii şi reparării oaselor, osteomielită, hiperparatiroidismului nutriţional secundar şi activitatea ovulatorie (23,32).

Creşterea în ALP  a fost asociată cu bolile hepatice; cu toate acestea, ALP este asociat şi cu activitatea crescută a membranelor celulare lucru ce nu indică leziuni hepatocelulare.

Aspartat aminotransferaza (AST, GOT) este o enzimă citosolică, la fel ca alanin aminotranoferaza şi provine dintr-o varietate de ţesuturi, inclusiv ficat, inimă, muşchii scheletici, creier şi rinichi.

Cu toate că se produc variaţii interspecifice ale valorilor de distribuţie AST în ţesuturile aviare, creşterile semnificative sunt de obicei un indicator al alterărilor morfofuncţionale ale hepatocitelor sau musculare  recente la cele mai multe specii. Cu toate că AST nu are specificitate hepatică, este cea mai utilă enzima  plasmatică pentru detectarea boliilor hepato-biliare la speciile de păsări (23).

AST ar trebui să fie utilizate în combinaţie cu alte teste diagnostice, cum ar fi creatinin kinaza  şi acizii biliari, ca un mijloc de creştere a valorii sale de diagnostic. Scăderea activitatii  AST poate indica scaderea  masei hepatice.

Lactat dehidrogenaza (LDH) se regăseşte în majoritatea ţesuturilor aviare şi nu este specifică unui organ in mod special, plasmă sau valoarea serică pot creşte cu afecţiunile hepatice sau musculare. Scăderea LDH poate avea ca rezultat pierderea masei hepatocelulare.

Electroforeza proteinelor

Electroforeza proteinelor (EPH) este un instrument util pentru diagnosticul şi evaluarea distribuţiei proteinelor, precum şi diagnoza şi monitorizarea terapeutica a multor boli. EPH identifică 5 vârfuri distincte, inclusiv prealbumina, albumina, alfa, beta şi gama globulinele. O scădere a albuminei şi a fracţiunilor de globulina pot indica insuficienţă hepatică. O creştere a albuminei este frecvent indicator de deshidratare, în timp ce o creştere a alfa, beta şi fracţiunilor gama globulina pot constitui un barometru de inflamaţie sistemică, posibilă ca urmare a unei hepatopatii (23).

Acizii biliari

Creşterea acizilor biliari pare a fi un indicator sensibil al bolilor şi funcţiei hepatice reduse la păsări, cu excepţia cazului deficitului stocării de fier în acest caz acizii biliari neputând creşte.

Valorile acizilor biliari mai mici de 100μmol/L sunt considerate normale, cele cuprinse între 90-120 μmol/l sunt considerate suspecte, iar valorile mai mari de 120 μmol/l sunt considerate de diagnosticare pentru boli hepatice (23).

Creştera postprandiala a acizilor biliari a fost deasemenea observata la mai multe specii de păsări, cele sănătoase nearatand nici o diferenţă semnificativă in concentraţia acizilor biliari. Deşi concentraţiile acizilor biliari pot fi un indicator sensibil al bolii hepatice şi insuficientei hepatice acestea nu indică tipul bolii. Biopsia însoţită de examen histopatologic sau microbiologic ar fi necesară pentru a determina etiologia unui ficat bolnav.

Valoarea acizilor biliari mai mici decât cele preconizate sunt asociate cu ciroza, pene de proastă calitate, precum şi ciocuri prea mari sau diforme. Nivelul acizilor biliari pot fi de asemenea utilizate pentru a monitoriza răspunsul la tratament (23).În concluzie, aflatoxinele sunt recunoscute ca fiind cei mai cancerigeni compuşi naturali, şi este posibil să se obţină o relaţie liniară între incidenţa cancerului primitiv de ficat şi logaritmul procentului de aflatoxină ingerată. Intoxicaţia acută cu aflatoxină se traduce prin moarte şi în general cu simptome de depresie, anorexie, diaree, icter sau anemie. Mai presus de orice,leziunile hepatice (necrozele şi cirozele) evoluează în final cu hepatome sau carcinoame. Formele cronice ale aflatoxicozelor se traduc printr-o scădere a performanţelor de creştere a animalelor, anemie, icter redus şi o evoluţie canceroasă în final (4,6,7).

Referinte

Conf. dr. -  Carmen SOLCAN